Badania nad szczepionkÄ… przeciwko ASF - odp. MRiRW

W latach 2017-2020 w ramach projektu NCN: „Konstrukcja rekombinowanego szczepu wirusa afrykaÅ„skiego pomoru Å›wiÅ„ (ASFV) przy użyciu techniki CRISPR/Cas9” prowadzane byÅ‚y badania majÄ…ce na celu uzyskanie i zbadanie wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci biologicznych rekombinowanego szczepu ASFV pozbawionego genów A238L, EP402R i 9GL.

W ramach podjÄ™tych w PlWet-PIB badaÅ„ zastosowano innowacyjnÄ… technikÄ™ CRISPR/Cas9 (regularnie zgrupowanych i oddzielonych krótkich sekwencji palindromowych), stanowiÄ…cÄ… obecnie najbardziej nowoczesne narzÄ™dzie inżynierii genetycznej.

W ramach tego dziaÅ‚ania prowadzono serie pasaży wraz z manipulacjÄ… medium odżywczym w celu uwrażliwienia komórek linii ciÄ…gÅ‚ej na infekcjÄ™ wirusa. Manipulacjom i sprawdzeniu podlegaÅ‚y linie komórkowe takie jak: VERO, IPAM, COS-1, MARC-145. Ze wzglÄ™du na wyniki prób adaptacji, transfekcjÄ™ prowadzono na pierwotnej linii komórkowej makrofagów pÅ‚ucnych Å›wiÅ„ (PPAM) dla której uzyskano najlepsze wskaźniki replikacji wirusa.

Po pomyÅ›lnie przeprowadzonej transfekcji hodowle komórkowe selekcjonowano z użyciem puromycyny i zakażano szczepem terenowym Poll8_28298_Olll. Wybrane hodowle komórkowe poddano sprawdzeniu z użyciem konwencjonalnej techniki PCR. Na tym etapie wykluczono możliwość mutacji dotyczÄ…cej genu A238L - otrzymano produkty reakcji PCR dla tego genu.

WÅ‚aÅ›ciwoÅ›ci rekombinowanego szczepu ASFV zostaÅ‚y zbadane in vitro w hodowlach komórek makrofagów pÅ‚ucnych (PPAM) i izolowanych leukocytach Å›wiÅ„. Rekombinowany wirus zachowaÅ‚ zdolność do namnażania siÄ™ w zakażonych komórkach hodowli z takÄ… samÄ… dynamikÄ…, jak wirus  macierzysty użyty do badaÅ„.

W koÅ„cowym etapie projektu przeprowadzono badania z użyciem 30 Å›wiÅ„ o znanym statusie immunologicznym W maju 2019 roku rozpoczÄ™to doÅ›wiadczenie z użyciem 14 Å›wiÅ„, w wieku 5 tygodni, które podzielono na 2 grupy. Osiem Å›wiÅ„ z grupy badanej zakażono donosowo zjadliwym szczepem terenowym. GrupÄ™kontrolnÄ… (niezakażonÄ…) stanowiÅ‚o 6 Å›wiÅ„.

Bardzo interesujÄ…cy jest fakt wyraźnie zwiÄ™kszonej serokonwersji w grupach Szczepionych” szczepem rekombinowanym ASFV. Taki wynik może być nastÄ™pstwem zarówno zmian we wÅ‚aÅ›ciwoÅ›ciach wirusa wywoÅ‚anych np. poprzez manipulacje genetyczne, jak również może być wynikiem zmiennoÅ›ci osobniczej i predyspozycji genetycznych Å›wiÅ„. Wskaźniki Å›miertelnoÅ›ci nie pozostawiajÄ… wÄ…tpliwoÅ›ci jednak, że wywoÅ‚ana odpowiedź immunologiczna wÅ›ród grup „szczepionych” wirusem rekombinowanym nie ma istotnego wpÅ‚ywu na przeżywalność Å›wiÅ„.PrzyczynÄ… tego zjawiska jest brak wytwarzanych po zakażeniu ASFV przeciwciaÅ‚ neutralizujÄ…cych. Wysoka Å›miertelność mimo obecnoÅ›ci przeciwciaÅ‚ jest gÅ‚ównym problemem w badaniach nad szczepionkÄ… przeciw ASFV. Ponadto stwierdzony brak odpornoÅ›ci u „szczepionych” Å›wiÅ„ w takich przypadkach można tÅ‚umaczyć poprzez prawdopodobny brak immunologicznej odpowiedzi komórkowej z udziaÅ‚em cytotoksycznych limfocytów TCD8+, podczas gdy obserwowane przeciwciaÅ‚a stanowiÄ… tylko indykatory zakażenia niezdolne do neutralizacji wirusa.

Równolegle do prowadzonych badaÅ„ zespóÅ‚ KLR ds. ASF prowadziÅ‚ poszukiwania szczepów naturalnie atenuowanych, mogÄ…cych stanowić potencjalny materiaÅ‚ szczepionkowy.

W 2017 roku zespóÅ‚ KLR ds. ASF zidentyfikowaÅ‚ 5 unikalnych mutacji dotyczÄ…cych genów MGF 110-7L, MGF 5O5-5R. KI45R. I267L oraz DP60R . Z czego 1 mutacja byÅ‚a cicha a pozostaÅ‚e zmieniaÅ‚y sekwencje aminokwasowe mogÄ…ce mieć wpÅ‚yw na wirulencjÄ™ patogenu. Jak pokazaÅ‚y późniejsze badania kliniczne - mutacje te pozostaÅ‚y bez wpÅ‚ywu na przebieg ASF u zakażonych Å›wiÅ„.

W latach 2019-2021 w ramach dofinansowania z Ministerstwa Rolnictwa - temat S/932: “ZwiÄ™kszenie potencjaÅ‚u naukowo-badawczego PIWet-PIB w celu opracowania szczepionki ASF” równolegle kontynuowano poszukiwanie szczepów naturalnie atenuowanych. W badaniach porównano 16 nowo otrzymanych sekwencji caÅ‚ego genomu terenu Polski do dotychczas posiadanych sekwencji polskich i sekwencji wirusa „macierzystego” z obszaru Gruzji z 2OO7r. Badania genetyczne ujawniÅ‚y brak mutacji w genach strategicznych dla wirulencji ASF, wobec czego zaniechano prób klinicznych z użyciem szczepów terenowych do czasu uzyskania odpowiednio rokujÄ…cych kandydatów szczepionkowych. Na uwagÄ™ zasÅ‚uguje fakt, że analizy genetyczne ujawniÅ‚y szereg pomniejszych różnic genetycznych w genach O174L. K145R. MGF 5O5-5R i regionie miÄ™dzy- genowym IGR I73R/I329L pozwalajÄ…cych wykorzystać je jako markery przydatne w Å›ledzeniu rozprzestrzeniania siÄ™ ASF na terenie Polski.

W trakcie badaÅ„ klinicznych, które zostaÅ‚y przeprowadzone w ramach projektu NCN: „Konstrukcja rekombinowanego szczepu wirusa afrykaÅ„skiego pomoru Å›wiÅ„ (ASFV) przy użyciu techniki CRISPR,'Cas9” uzyskano cenny materiaÅ‚ od Å›wiÅ„-ozdrowieÅ„ców. Który podlegaÅ‚ m. in. analizie pod kÄ…tem odpowiedzi immunologicznej zachodzÄ…cej w przebiegu choroby.

Na podstawie przeprowadzonych badaÅ„ w zakresie odpowiedzi immunologicznej w wnioskuje siÄ™ z dużym prawdopodobieÅ„stwem, że do efektywnego zwalczania choroby niezbÄ™dna jest odpowiedź z dwóch komponent ukÅ‚adu immunologicznego tj. odpowiedzi immunologicznej humoralnej (wys. miana przeciwciaÅ‚) i odpowiedzi immunologicznej komórkowej (wzrost odsetka limfocytów T).

W okresie od 2021 r. do chwili obecnej W ramach badania odpowiedzi immunologicznej przeciw ASFV, szczególnÄ… uwagÄ™ poÅ›wiÄ™cono na zbadanie interakcji przeciwciaÅ‚o-patogen w ASF. W ramach badaÅ„ wyselekcjonowano surowice pochodzÄ…ce od dobrze udokumentowanych przypadków ozdrowieÅ„ców.

Wyselekcjonowane surowice (3 surowice pochodzÄ…ce od dzików, 2 surowice pochodzÄ…ce od Å›wiÅ„) poddano badaniom in vitro w celu przeÅ›ledzenia możliwoÅ›ci neutralizacji ASFV. Makrofagi pÅ‚ucne pobrane od Å›wiÅ„ zakażono terenowym szczepem ASF Pol_18_28298_Ol 11 w obecnoÅ›ci wybranych surowic w dwóch stężeniach (10% i 20%). Wszystkie surowice poddano mianowaniu przeciwciaÅ‚ i wykazano ich wysokie miano.

Wyniki badaÅ„ dowiodÅ‚y, że pomimo zahamowania hemadsorpcji, replikacja wirusa zachodzi. Ma to prawdopodobnie zwiÄ…zek z mechanizmem internalizacji wirusa (makropinocytoza konstytutwyna), który w przeciwieÅ„stwie do innych znanych wirusów (np. Sars-COV-2) nie posiada strategicznych receptorów koniecznych do internalizacji, a tym samym nie istniejÄ… przeciwciaÅ‚a zdolne do zablokowania tychże receptorów (stÄ…d prawdopodobnie niepowodzenia szczepionek inaktywowanych i podjednostkowych). Wyniki te podkreÅ›liÅ‚y, że w organizmie gospodarza podczas efektywnego zwalczania choroby dochodzi do wspóÅ‚grania komponenty humoralnej i komórkowej. Wyniki przedstawiono w publikacji naukowej w 2022 roku W latach 2021-2023 zaplanowano wspólny miÄ™dzynarodowy projekt z ramienia programu ERA NET 1CRAD (IFNASF), wniosek zostaÅ‚ zÅ‚ożony w sierpniu 2020 przez konsorcjum:

Celem projektu jest zidentyfikowanie genów odpowiedzialnych za hamowanie wydzielania interferonu typu I, a nastÄ™pnie wprowadzenie mutacji nakierowanej na zidentyfikowane geny wirusa ASFV.

PrzewagÄ… projektu jest zastosowanie innowacyjnej techniki single-cell RNA- sequencing (scRNA-seq) umożliwiajÄ…cej Å›ledzenie mechanizmów regulacji wydzielania interferonu w pojedynczych komórkach, identyfikacjÄ™ subpopulacji komórek, w których w/w regulacja zachodzi oraz identyfikacjÄ™ genów ulegajÄ…cych ekspresji w procesie hamowania wydzielania interferonu.

• Centrum Biologii Molekularnej „Severo Ochoa” (Hiszpania),
• Uniwersytet Ludwiga Maksymiliana w Monachium (Niemcy)
• Szwedzki Narodowy Instytut Weterynaryjny (Szwecja).

Celem projektu jest zidentyfikowanie genów odpowiedzialnych za hamowanie wydzielania interferonu typu I, a nastÄ™pnie wprowadzenie mutacji nakierowanej na zidentyfikowane geny wirusa ASFV.

PrzewagÄ… projektu jest zastosowanie innowacyjnej techniki single-cell RNA- sequencing (scRNA-seq) umożliwiajÄ…cej Å›ledzenie mechanizmów regulacji wydzielania interferonu w pojedynczych komórkach, identyfikacjÄ™ subpopulacji komórek, w których w/w regulacja zachodzi oraz identyfikacjÄ™ genów ulegajÄ…cych ekspresji w procesie hamowania wydzielania interferonu.

W dalszym etapie projektu w wirulentnych szczepach ASFV zidentyfikowane geny zostaną poddane mutacji z użyciem techniki CRISPR?Cas9.

RównoczeÅ›nie pragnÄ™ zapewnić, że dziaÅ‚ania zwiÄ…zane ze zwalczaniem i zapobieganiem ASF w Polsce sÄ… prowadzone w sposób ciÄ…gÅ‚y.

Realizowana jest redukcja populacji dzików w pierwszej kolejnoÅ›ci w ramach planowej gospodarki Å‚owieckiej (kompetencje Ministra Klimatu i Åšrodowiska) oraz uzupeÅ‚niajÄ…co w ramach odstrzaÅ‚u sanitarnego (nakazywanego przez powiatowych lekarzy weterynarii lub wojewodów – na wniosek wojewódzkich lekarzy weterynarii).

Systematycznie prowadzenie sÄ… akcje poszukiwania padÅ‚ych dzików i ich szczÄ…tków na terenach wystÄ™powania ASF oraz terenach zagrożonych wystÄ™powaniem choroby – celem ich eliminacji ze Å›rodowiska. W akcjach poszukiwawczych wykorzystywane sÄ… dodatkowo odpowiednio przeszkolone psy, a skuteczność ich dziaÅ‚ania oceniana jest bardzo wysoko.

W przypadku pozyskiwania dzików duży nacisk kÅ‚adziony jest również na kwestie przestrzegania przez myÅ›liwych i osoby biorÄ…ce udziaÅ‚ w polowaniach zasad bioasekuracji. Inspekcja Weterynaryjna wykonuje w zakresie m.in. kontrole punktów przetrzymywania tusz odstrzelonych dzików w zakresie weryfikacji speÅ‚niania tych zasad.

Kolejnym elementem walki z ASF jest ograniczanie dalszego szerzenia siÄ™ choroby po przez budowanie sztucznych barier majÄ…cych na celu spowalnianie przemieszczania siÄ™ dzików, w szczególnoÅ›ci w okresie inkubacji choroby (ogrodzenia i zamykanie przejść dla zwierzÄ…t wzdÅ‚uż dróg ekspresowych i autostrad, bariery w postaci ogrodzeÅ„ siatkowych, bariery zapachowe, odÅ‚ownie żywoÅ‚owne).

Ponadto prowadzony jest w Polsce pasywny i aktywny monitoring u dzików i Å›wiÅ„, w celu wczesnego wykrywania zakażenia i szybkiego wdrożenia dziaÅ‚aÅ„ zmierzajÄ…cych do przerwania Å‚aÅ„cucha szczerzenia siÄ™ choroby i jej zwalczenia. Likwidacja ognisk choroby jest realizowana sprawnie i zachowaniem odpowiednich procedur przez organy Inspekcji Weterynaryjnej.

Kolejnym istotnym elementem w zwalczaniu choroby jest także niezwÅ‚oczne reagowanie organów Inspekcji Weterynaryjnej na podejrzenia ASF w stadzie w tym w szczególnoÅ›ci rzetelne prowadzenie dochodzenia epizootycznego, zabezpieczenie miejsca podejrzenia, pobranie próbek i ich wysyÅ‚ka do laboratorium diagnostycznego oraz przekazanie informacji do wÅ‚adz zwierzchnich o podejrzeniu. Warto podkreÅ›lić, że istotnÄ… rolÄ™ w szybkim wykryciu i likwidacji choroby w stadzie odgrywajÄ… również hodowcy Å›wiÅ„. NiezwÅ‚oczne zgÅ‚oszenie do lekarza weterynarii niepokojÄ…cych objawów u Å›wiÅ„, ogranicza ryzyko zawleczenia choroby do innych gospodarstw.

MajÄ…c jednak na wglÄ…dzie, że usuwanie skutków choroby pociÄ…ga za sobÄ… dodatkowe koszty oraz prowadzi do dodatkowych obostrzeÅ„ i ograniczeÅ„ wynikajÄ…cych z obowiÄ…zujÄ…cych w tym zakresie przepisów, w realizowanych dziaÅ‚aniach duży nacisk jest poÅ‚ożony na bioasekuracjÄ™ gospodarstw.

W tym zakresie Inspekcja Weterynaryjna planowo wykonuje kontrole gospodarstw utrzymujących świnie w zakresie spełniania wymagań bioasekuracji. Kontrolne bioasekuracji stanowią istotny element zapobiegający zawleczeniu choroby do gospodarstw utrzymujących świnie. Właściwa bioasekuracja gospodarstw i stosowanie się do wynikających z niej zasad, stanowią bowiem istotny element minimalizujący ryzyka przeniesienia wirusa na teren takich gospodarstw, zwłaszcza w sezonie intensyfikacji prac polowych.

Ważnym aspektem dziaÅ‚aÅ„ zaradczych sÄ… dziaÅ‚ania informacyjne oraz szkoleniowe. Dlatego też w szczególnoÅ›ci do hodowców, lekarzy weterynarii, myÅ›liwych, kierowane sÄ… równego rodzaju akcje informacyjne, szkolenia, konferencje odnoÅ›nie zagrożenia chorobÄ… i roli bioasekuracji w ochronie przed ASF. Na stronach internetowych Inspekcji, PaÅ„stwowego Instytutu Weterynaryjnego – PaÅ„stwowego Instytutu Badawczego w PuÅ‚awach, OÅ›rodków Doradztwa Rolniczego czy Generalnej Dyrekcji Lasów PaÅ„stwowych prowadzone sÄ… staÅ‚e zakÅ‚adki na temat ASF.